DNA-Methylierungstests kombiniert mit Smartphones zur Früherkennung von Tumoren und Leukämie-Screening mit einer Genauigkeit von 90,0 %!

Die Früherkennung von Krebs auf der Grundlage der Flüssigbiopsie ist eine neue Richtung der Krebserkennung und -diagnose, die in den letzten Jahren vom US-amerikanischen National Cancer Institute vorgeschlagen wurde, mit dem Ziel, Krebs im Frühstadium oder sogar präkanzeröse Läsionen zu erkennen. Es wird häufig als neuartiger Biomarker für die Frühdiagnose verschiedener bösartiger Erkrankungen eingesetzt, darunter Lungenkrebs, Magen-Darm-Tumoren, Gliome und gynäkologische Tumoren.

Das Aufkommen von Plattformen zur Identifizierung von Methylierungslandschafts-Biomarkern (Methylscape) hat das Potenzial, die bestehende Früherkennung von Krebs deutlich zu verbessern und Patienten in das früheste behandelbare Stadium zu bringen.

Kürzlich haben Forscher eine einfache und direkte Sensorplattform zur Erkennung von Methylierungslandschaften entwickelt, die auf mit Cysteamin dekorierten Goldnanopartikeln (Cyst/AuNPs) in Kombination mit einem Smartphone-basierten Biosensor basiert und ein schnelles Frühscreening einer Vielzahl von Tumoren ermöglicht. Ein Frühscreening auf Leukämie kann innerhalb von 15 Minuten nach der DNA-Extraktion aus einer Blutprobe mit einer Genauigkeit von 90,0 % durchgeführt werden. Der Titel des Artikels lautet „Schneller Nachweis von Krebs-DNA im menschlichen Blut mithilfe von Cysteamin-bedeckten AuNPs und einem Smartphone, das maschinelles Lernen unterstützt“.

Abbildung 1. Eine einfache und schnelle Erkennungsplattform für die Krebsvorsorge mittels Zysten-/AuNP-Komponenten kann in zwei einfachen Schritten erstellt werden.

Dies ist in Abbildung 1 dargestellt. Zunächst wurde eine wässrige Lösung verwendet, um die DNA-Fragmente aufzulösen. Anschließend wurden der gemischten Lösung Zysten/AuNPs zugesetzt. Normale und bösartige DNA weisen unterschiedliche Methylierungseigenschaften auf, was zu DNA-Fragmenten mit unterschiedlichen Selbstassemblierungsmustern führt. Normale DNA aggregiert locker und aggregiert schließlich Cyst/AuNPs, was zu einer Rotverschiebung der Cyst/AuNPs führt, sodass mit bloßem Auge ein Farbwechsel von Rot nach Lila beobachtet werden kann. Im Gegensatz dazu führt das einzigartige Methylierungsprofil der Krebs-DNA zur Produktion größerer Cluster von DNA-Fragmenten.

Bilder von 96-Well-Platten wurden mit einer Smartphone-Kamera aufgenommen. Krebs-DNA wurde mit einem Smartphone gemessen, das mit maschinellem Lernen im Vergleich zu spektroskopischen Methoden ausgestattet war.

Krebsvorsorgeuntersuchung in echten Blutproben

Um den Nutzen der Sensorplattform zu erweitern, verwendeten die Forscher einen Sensor, der in echten Blutproben erfolgreich zwischen normaler und krebsartiger DNA unterscheiden konnte. Methylierungsmuster an CpG-Stellen regulieren epigenetisch die Genexpression. Bei fast allen Krebsarten wurden abwechselnd Veränderungen in der DNA-Methylierung und damit in der Expression von Genen beobachtet, die die Tumorentstehung fördern.

Als Modell für andere Krebsarten, die mit DNA-Methylierung in Zusammenhang stehen, verwendeten die Forscher Blutproben von Leukämiepatienten und gesunden Kontrollpersonen, um die Wirksamkeit der Methylierungslandschaft bei der Differenzierung leukämischer Krebsarten zu untersuchen. Dieser Methylierungslandschafts-Biomarker übertrifft nicht nur bestehende schnelle Leukämie-Screening-Methoden, sondern zeigt auch, dass dieser einfache und unkomplizierte Test auf die Früherkennung eines breiten Spektrums von Krebsarten ausgeweitet werden kann.

Es wurde DNA aus Blutproben von 31 Leukämiepatienten und 12 gesunden Personen analysiert. Wie im Kastendiagramm in Abbildung 2a gezeigt, war die relative Absorption der Krebsproben (ΔA650/525) niedriger als die der DNA aus normalen Proben. Dies war hauptsächlich auf die erhöhte Hydrophobie zurückzuführen, die zu einer dichten Aggregation der Krebs-DNA führte, wodurch die Aggregation von Zysten/AuNPs verhindert wurde. Infolgedessen waren diese Nanopartikel vollständig in den äußeren Schichten der Krebsaggregate verteilt, was zu einer unterschiedlichen Verteilung von Zysten/AuNPs führte, die an normalen und Krebs-DNA-Aggregaten adsorbiert waren. Anschließend wurden ROC-Kurven erstellt, indem der Schwellenwert von einem Minimalwert von ΔA650/525 bis zu einem Maximalwert variiert wurde.

Abbildung 2.(a) Relative Absorptionswerte von Zysten/AuNPs-Lösungen, die das Vorhandensein von normaler (blau) und Krebs-DNA (rot) unter optimierten Bedingungen zeigen

(DA650/525) von Boxplots; (b) ROC-Analyse und Auswertung diagnostischer Tests. (c) Verwirrungsmatrix für die Diagnose von Normal- und Krebspatienten. (d) Sensitivität, Spezifität, positiver Vorhersagewert (PPV), negativer Vorhersagewert (NPV) und Genauigkeit der entwickelten Methode.

Wie in Abbildung 2b dargestellt, zeigte die für den entwickelten Sensor erhaltene Fläche unter der ROC-Kurve (AUC = 0,9274) eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität. Wie aus dem Boxplot ersichtlich ist, ist der niedrigste Punkt, der die normale DNA-Gruppe darstellt, nicht gut vom höchsten Punkt, der die Krebs-DNA-Gruppe darstellt, getrennt; Daher wurde die logistische Regression verwendet, um zwischen der normalen und der Krebsgruppe zu unterscheiden. Anhand einer Reihe unabhängiger Variablen wird die Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines Ereignisses geschätzt, beispielsweise einer Krebserkrankung oder einer normalen Gruppe. Die abhängige Variable liegt zwischen 0 und 1. Das Ergebnis ist daher eine Wahrscheinlichkeit. Wir haben die Wahrscheinlichkeit der Krebserkennung (P) basierend auf ΔA650/525 wie folgt bestimmt.

wobei b=5,3533,w1=-6,965. Bei der Probenklassifizierung weist eine Wahrscheinlichkeit von weniger als 0,5 auf eine normale Probe hin, während eine Wahrscheinlichkeit von 0,5 oder höher auf eine Krebsprobe hinweist. Abbildung 2c zeigt die aus der Leave-it-alone-Kreuzvalidierung generierte Verwirrungsmatrix, die zur Validierung der Stabilität der Klassifizierungsmethode verwendet wurde. Abbildung 2d fasst die diagnostische Testbewertung der Methode zusammen, einschließlich Sensitivität, Spezifität, positivem Vorhersagewert (PPV) und negativem Vorhersagewert (NPV).

Smartphone-basierte Biosensoren

Um die Probenprüfung ohne den Einsatz von Spektrophotometern weiter zu vereinfachen, verwendeten die Forscher künstliche Intelligenz (KI), um die Farbe der Lösung zu interpretieren und zwischen normalen und krebskranken Personen zu unterscheiden. Vor diesem Hintergrund wurde Computer Vision verwendet, um die Farbe der Zysten/AuNPs-Lösung mithilfe von Bildern von 96-Well-Platten, die mit einer Mobiltelefonkamera aufgenommen wurden, in normale DNA (lila) oder krebsartige DNA (rot) zu übersetzen. Künstliche Intelligenz kann die Kosten senken und die Zugänglichkeit bei der Interpretation der Farbe von Nanopartikellösungen verbessern, und das ohne den Einsatz optischer Hardware für Smartphone-Zubehör. Schließlich wurden zwei Modelle für maschinelles Lernen, darunter Random Forest (RF) und Support Vector Machine (SVM), trainiert, um die Modelle zu erstellen. Sowohl das RF- als auch das SVM-Modell klassifizierten die Proben mit einer Genauigkeit von 90,0 % korrekt als positiv und negativ. Dies deutet darauf hin, dass der Einsatz künstlicher Intelligenz in der mobiltelefonbasierten Biosensorik durchaus möglich ist.

Abbildung 3.(a) Zielklasse der Lösung, aufgezeichnet während der Vorbereitung der Probe für den Bildaufnahmeschritt. (b) Beispielbild, das während des Bildaufnahmeschritts aufgenommen wurde. (c) Farbintensität der Zysten/AuNPs-Lösung in jedem Well der 96-Well-Platte, extrahiert aus dem Bild (b).

Mithilfe von Zysten/AuNPs haben Forscher erfolgreich eine einfache Sensorplattform zur Erkennung von Methylierungslandschaften und einen Sensor entwickelt, der in der Lage ist, normale DNA von Krebs-DNA zu unterscheiden, wenn echte Blutproben für das Leukämie-Screening verwendet werden. Der entwickelte Sensor zeigte, dass aus echten Blutproben extrahierte DNA kleine Mengen Krebs-DNA (3 nM) bei Leukämiepatienten in 15 Minuten schnell und kostengünstig nachweisen konnte und eine Genauigkeit von 95,3 % aufwies. Um die Probenprüfung weiter zu vereinfachen, indem die Notwendigkeit eines Spektralfotometers entfällt, wurde maschinelles Lernen eingesetzt, um die Farbe der Lösung zu interpretieren und anhand eines Mobiltelefonfotos zwischen normalen und krebskranken Personen zu unterscheiden. Außerdem konnte eine Genauigkeit von 90,0 % erreicht werden.

Referenz: DOI: 10.1039/d2ra05725e