Interferenzfaktoren bei PCR -Reaktionen

Während der PCR -Reaktion werden häufig einige störende Faktoren auftreten.
Aufgrund der sehr hohen Empfindlichkeit der PCR wird eine Kontamination als einer der wichtigsten Faktoren angesehen, die die PCR -Ergebnisse beeinflussen und falsch positive Ergebnisse erzielen können.
Ebenso kritisch sind die verschiedenen Quellen, die zu falsch negativen Ergebnissen führen. Wenn ein oder mehrere wesentliche Teile der PCR -Mischung oder die Amplifikationsreaktion selbst gehemmt oder gestört werden, kann der diagnostische Assay behindert werden. Dies kann zu einer verringerten Effizienz und sogar zu falsch negativen Ergebnissen führen.
Zusätzlich zur Hemmung kann der Verlust der Zielnukleinsäure -Integrität aufgrund von Versand- und/oder Speicherbedingungen vor der Probenvorbereitung auftreten. Insbesondere hohe Temperaturen oder unzureichende Lagerung können zu einer Beschädigung von Zellen und Nukleinsäuren führen. Zell- und Gewebefixierung und Paraffineinbettung sind bekannte Ursachen für DNA -Fragmentierung und ein anhaltendes Problem (siehe Abbildungen 1 und 2). In diesen Fällen hilft auch eine optimale Isolation und Reinigung nicht.

Abbildung 1 | Wirkung der Immobilisierung auf die DNA -Integrität
Die Agarosegelelektrophorese zeigte, dass die Qualität der aus Paraffinabschnitten von Autopsien isolierten DNA erheblich variierte. DNA mit unterschiedlichen durchschnittlichen Fragmentlängen war in den Extrakten in Abhängigkeit von der Fixierungsmethode vorhanden. Die DNA wurde nur in nativen gefrorenen Proben und in gepuffertem neutralem Formalin konserviert. Die Verwendung eines stark sauren Bouin-fixativen oder ungelender, futtersäurehaltigen Formalins führte zu einem signifikanten Verlust der DNA. Die verbleibende Fraktion ist stark fragmentiert.
Links wird die Länge der Fragmente in Kilobasepaaren (KBP) ausgedrückt

Abbildung 2 | Verlust der Integrität von Nukleinsäurezielen
(A) Eine 3'-5'-Lücke bei beiden Strängen führt zu einer Bruch in der Ziel-DNA. Die Synthese der DNA tritt immer noch auf dem kleinen Fragment auf. Wenn jedoch auf dem DNA -Fragment eine Primer -Glühstelle fehlt, tritt nur eine lineare Amplifikation auf. Im günstigsten Fall können sich die Fragmente gegenseitig rezieren, die Ausbeuten sind jedoch gering und unter den Erkennungsniveaus.
(b) Verlust von Basen, hauptsächlich aufgrund von Depurination und Thymidin-Dimer-Bildung, führt zu einer Abnahme der Anzahl von H-Bindungen und einer Abnahme der TM. Während der länglichen Erwärmungsphase schmelzen die Primer von der Matrix -DNA und werden auch unter weniger strengen Bedingungen nicht ankündigen.
(c) benachbarte Thyminbasen bilden ein TT -Dimer.
Ein weiteres häufiges Problem, das häufig in der molekularen Diagnostik auftritt, ist die weniger als optimale Freisetzung von Zielnukleinsäuren im Vergleich zur Phenol-Chloroform-Extraktion. In extremen Fällen kann dies mit falschen Negativen verbunden werden. Viel Zeit kann durch kochende Lyse oder enzymatische Verdauung von Zelltrümmern gespeichert werden, aber diese Methode führt häufig zu einer geringen PCR -Empfindlichkeit aufgrund einer unzureichenden Nukleinsäurefreisetzung.

Hemmung der Polymeraseaktivität während der Amplifikation

Im Allgemeinen wird die Hemmung als Containerkonzept verwendet, um alle Faktoren zu beschreiben, die zu suboptimalen PCR -Ergebnissen führen. In einem streng biochemischen Sinne beschränkt sich die Hemmung auf die Aktivität des Enzyms, dh sie reduziert oder verhindert die Umwandlung von Substratprodukten durch Wechselwirkung mit der aktiven Stelle der DNA-Polymerase oder ihres Cofaktors (z. B. Mg2+ für Taq-DNA-Polymerase).
Komponenten in der Probe oder in verschiedenen Puffern und Extrakten, die Reagenzien enthalten, können das Enzym direkt hemmen oder seine Cofaktoren (z. B. EDTA) fangen, wodurch die Polymerase inaktiviert wird und wiederum zu verringerten oder falsch negativen PCR -Ergebnissen führt.
Viele Wechselwirkungen zwischen Reaktionskomponenten und zielhaltigen Nukleinsäuren werden jedoch auch als „PCR-Inhibitoren“ bezeichnet. Sobald die Integrität der Zelle durch Isolation gestört ist und die Nukleinsäure freigesetzt wird, können Wechselwirkungen zwischen der Probe und ihrer umgebenden Lösung und ihrer festen Phase auftreten. Beispielsweise können 'Scavengers' durch nichtkovalente Wechselwirkungen ein- oder doppelsträngige DNA binden und die Isolierung und Reinigung beeinträchtigen, indem die Anzahl der Ziele reduziert wird, die schließlich das PCR-Reaktionsgefäß erreichen.
Im Allgemeinen sind PCR -Inhibitoren in den meisten Körperflüssigkeiten und Reagenzien vorhanden, die für klinische diagnostische Tests (Harnstoff in Urin, Hämoglobin und Heparin im Blut), Nahrungsergänzungsmittel (organische Komponenten, Glykogen, Fett, Ca2+ -IONs) und Komponenten in der Umwelt (Phenole, Schwermethoden) verwendet werden.

Vorhäufigere PCR-Inhibitoren finden sich in Bakterien und eukaryotischen Zellen, nicht-zielgerichteten DNA, DNA-bindenden Makromolekülen von Gewebematrizen und Laborgeräten wie Handschuhen und Plastik. Die Reinigung von Nukleinsäuren während oder nach der Extraktion ist die bevorzugte Methode zum Entfernen von PCR -Inhibitoren.
Heutzutage können verschiedene automatisierte Extraktionsgeräte viele manuelle Protokolle ersetzen, aber eine 100% ige Wiederherstellung und/oder Reinigung von Zielen wurde nie erreicht. Mögliche Inhibitoren können immer noch in den gereinigten Nukleinsäuren vorhanden sein oder bereits wirksam haben. Es gibt unterschiedliche Strategien, um die Auswirkungen von Inhibitoren zu verringern. Die Wahl der geeigneten Polymerase kann einen signifikanten Einfluss auf die Inhibitoraktivität haben. Andere nachgewiesene Methoden zur Verringerung der PCR -Hemmung erhöhen die Polymerasekonzentration oder die Anwendung von Additive wie BSA.
Die Hemmung von PCR -Reaktionen kann durch die Verwendung der internen Prozessqualitätskontrolle (IPC) nachgewiesen werden.
Es muss darauf geachtet werden, alle Reagenzien und anderen Lösungen im Extraktionskit wie Ethanol, EDTA, Cetab, LiCl, Guscn, SDS, Isopropanol und Phenol aus dem Nukleinsäure -Isolat durch gründliche Waschschritte zu entfernen. Abhängig von ihrer Konzentration können sie die PCR aktivieren oder hemmen.