Durchführung von vier Nukleinsäureamplifikationstests zur Identifizierung von SARS-CoV-2 in Äthiopien

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Seit dem Ausbruch der Coronavirus-Erkrankung (COVID-19) im Jahr 2019 wurden weltweit viele kommerzielle Nukleinsäureamplifikationstests (NAATs) entwickelt, die zu Standardtests geworden sind. Obwohl schnell mehrere Tests entwickelt und in der Labordiagnostik eingesetzt wurden, wurde die Leistung dieser Tests nicht in zahlreichen Umgebungen evaluiert. Daher zielte diese Studie darauf ab, die Leistung der Tests Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI und Sansure Biotech unter Verwendung des Composite Reference Standard (CRS) zu bewerten. Die Studie wurde vom 1. bis 30. Dezember 2020 am Ethiopian Public Health Institute (EPHI) durchgeführt. 164 Nasen-Rachen-Proben wurden mithilfe des QIAamp RNA Mini-Kits und des Abbott DNA-Probenvorbereitungssystems extrahiert. Von 164 Proben waren 59,1 % positiv und 40,9 % negativ für CRS. Die Positivität bei Sansure Biotech war im Vergleich zu CRS signifikant niedrig (p < 0,05). Die Positivität bei Sansure Biotech war im Vergleich zu CRS signifikant niedrig (p < 0,05). Die neuesten Ergebnisse von Sansure Biotech wurden erst kürzlich mit CRS bewertet (p < 0,05). Die positiven Ergebnisse von Sansure Biotech waren im Vergleich zu CRS signifikant niedriger (p < 0,05).与CRS-Bericht, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）.与CRS-Bericht, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）. Bei Sansure Biotech wurden mehrere zusätzliche Ergebnisse nach CRS ermittelt (p < 0,05). Sansure Biotech hatte im Vergleich zu CRS signifikant weniger positive Ergebnisse (p < 0,05).Die Gesamtübereinstimmung der vier Analysen lag im Vergleich zum CRS bei 96,3–100 %. Trotz der niedrigen Positivitätsrate des Sansure Biotech-Tests war die Leistung der vier Tests nahezu vergleichbar. Daher bedarf der Sansure Biotech [Research Only (RUO)]-Test für den Einsatz in Äthiopien einer zusätzlichen Validierung. Abschließend sollten weitere Untersuchungen in Betracht gezogen werden, um Tests mit den entsprechenden Herstellerangaben zu bewerten.
Labortests sind Teil des Strategischen Plans der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zur Vorbereitung und Reaktion auf die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) (SPRP). Die WHO empfiehlt den Ländern, ihre Laborkapazitäten auszubauen, um die Vorsorge, das Fallmanagement, die Wachsamkeit und die schnelle Reaktion auf Herausforderungen im Bereich der öffentlichen Gesundheit zu verbessern. Dies deutet darauf hin, dass Labore eine zentrale Rolle bei der Charakterisierung der Krankheit und der Epidemiologie neu auftretender Infektionserreger sowie bei der Eindämmung ihrer Ausbreitung spielen.
Die Diagnose von COVID-19 erfordert epidemiologische und medizinische Informationen, persönliche Symptome/Anzeichen sowie Röntgen- und Labordaten2. Seit dem gemeldeten COVID-19-Ausbruch in Wuhan, China, wurden weltweit viele kommerzielle Nukleinsäureamplifikationstests (NAATs) entwickelt. Die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (rRT-PCR) wird als Routine- und Standardmethode zur Labordiagnose einer Infektion mit dem Schweren Akuten Respiratorischen Syndrom 2 (SARS-CoV-2)3 verwendet. Der molekulare Nachweis von SARS-CoV-2 basiert typischerweise auf den Genen N (Nukleokapsidprotein-Gen), E (Hüllprotein-Gen) und RdRp (RNA-abhängiges RNA-Polymerase-Gen) im ORF1a/b-Bereich (offener Leserahmen 1a/b). Sie gelten als die wichtigsten konservierten Regionen in viralen Genomen für die Viruserkennung4. Von diesen Genen weisen die Gene RdRp und E eine hohe analytische Nachweissensitivität auf, während das N-Gen eine niedrige analytische Sensitivität aufweist5.
Die Leistung von PCR-Tests kann je nach verschiedenen Faktoren variieren, wie z. B.: Extraktionsreagenzien, Amplifikations-/Nachweisreagenzien, Extraktionsmethode, Qualität des PCR-Geräts und anderer Instrumente. Seit April 2020 haben mehr als 48 verschiedene Diagnosegeräte aus neun Ländern eine Notfallzulassung (EUA) für die COVID-196-Diagnostik erhalten. In Äthiopien werden in 26 öffentlichen Gesundheitseinrichtungen mehr als 14 Echtzeit-PCR-Plattformen zum PCR-Nachweis von SARS-CoV-2 verwendet, darunter ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 und Quant-studio7. Darüber hinaus sind verschiedene PCR-Testkits verfügbar, wie z. B. der Daan Gene-Test, der Abbott SARS-CoV-2-Test, der Sansure Biotech-Test und der SARS-CoV-2 BGI-Test. Obwohl die rRT-PCR hochempfindlich ist, melden einige Patienten mit COVID-19 falsch negative Ergebnisse. Dies liegt an unzureichenden Kopien der viralen Ribonukleinsäure (RNA) in den Proben aufgrund unsachgemäßer Entnahme, Transport, Lagerung und Handhabung sowie Labortests. Bedingungen und Handlungen des Personals8. Außerdem können eine falsche Handhabung von Proben oder Kontrollen, die Einstellung des Zyklusschwellenwerts (Ct) und Kreuzreaktivität mit anderen pathogenen Nukleinsäuren oder inaktiver/restlicher SARS-CoV-2-RNA zu falsch positiven Ergebnissen in rRT-PCR9-Tests führen. Somit ist klar, dass PCR-Tests sehr wohl Träger von Genfragmenten identifizieren können, da sie nicht einmal zwischen wirklich aktiven viralen Genen unterscheiden können, sodass die Tests nur Träger und nicht Patienten identifizieren können10. Deshalb ist es wichtig, die diagnostische Leistung in unserem Umfeld mit Standardmethoden zu beurteilen. Obwohl viele NAAT-Reagenzien am Ethiopian Public Health Institute (EPHI) und im ganzen Land erhältlich sind, wurde bisher über keine vergleichende Bewertung ihrer Wirksamkeit berichtet. Daher zielte diese Studie darauf ab, die vergleichende Leistung handelsüblicher Kits für den Nachweis von SARS-CoV-2 durch rRT-PCR anhand klinischer Proben zu bewerten.
Insgesamt wurden 164 Teilnehmer mit Verdacht auf COVID-19 in die Studie einbezogen. Die Mehrheit der Proben stammte aus Behandlungszentren (118/164 = 72 %), während die restlichen 46 (28 %) Teilnehmer aus Nicht-Behandlungszentren stammten. Von den nicht im Zentrum behandelten Teilnehmern hatten 15 (9,1 %) klinische Verdachtsfälle und 31 (18,9 %) Kontakt zu bestätigten Fällen. 93 (56,7 %) Teilnehmer waren männlich, und das Durchschnittsalter (± SD) der Teilnehmer betrug 31,10 (± 11,82) Jahre.
In dieser Studie wurden die Positiv- und Negativraten von vier COVID-19-Tests ermittelt. So lagen die Positivraten des Abbott SARS-CoV-2-Tests, des Daan Gene 2019-nCoV-Tests, des SARS-CoV-2 BGI-Tests und des Sansure Biotech 2019-nCoV-Tests bei 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % bzw. 55,5 %. Die positiven und negativen zusammengesetzten Referenzstandardwerte (CRS) lagen bei 97 (59,1 %) bzw. 67 (40,9 %) (Tabelle 1). In dieser Studie basierte die Definition des CRS auf der „Jedes-Positive“-Regel, wonach von vier Testergebnissen zwei oder mehr Testergebnisse, die dasselbe Ergebnis lieferten, als richtig positiv oder richtig negativ gewertet wurden.
In dieser Studie stellten wir für alle Analysen im Vergleich zum CRS eine negative prozentuale Übereinstimmung (NPA) von 100 % (95 % KI 94,6–100) fest. Die Sansure Biotechnology-Analyse zeigte eine minimale PPA von 93,8 % (95 % KI 87,2–97,1), und die Daan Gene 2019-nCoV-Analyse wies eine Gesamtübereinstimmung von 99,4 % (95 % KI 96,6–99,9) auf. Im Gegensatz dazu betrug die Gesamtübereinstimmung zwischen dem SARS-CoV-2 BGI-Test und dem Sansure Biotech 2019-nCoV-Test 98,8 % bzw. 96,3 % (Tabelle 2).
Der Cohen-Kappa-Übereinstimmungskoeffizient zwischen den CRS- und Abbott-SARS-CoV-2-Testergebnissen war vollständig konsistent (K = 1,00). Ebenso stimmen die von Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI und Sansure Biotech 2019-nCoV ermittelten Cohen-Kappa-Werte vollständig mit CRS überein (K ≥ 0,925). In dieser vergleichenden Analyse zeigte der Chi-Quadrat-Test (McNemar-Test), dass die Sansure Biotech 2019-nCoV-Testergebnisse signifikant von den CRS-Ergebnissen abwichen (p = 0,031) (Tabelle 2).
Wie in Abb. gezeigt.1 Der Prozentsatz des niedrigsten Ct-Werts (< 20 Ct) des Abbott SARS-CoV-2-Tests (kombiniertes RdRp- und N-Gen) betrug 87,6 % und der ORF1a/b-Gen-Ct-Wert des Sansure Biotech 2019-nCoV-Tests zeigte, dass der Prozentsatz des niedrigen Ct-Werts (< 20 Ct) 50,3 % und der hohe Ct-Wert (36–40 Ct) 3,2 % betrug. 1 Der Prozentsatz des niedrigsten Ct-Werts (< 20 Ct) des Abbott SARS-CoV-2-Tests (kombiniertes RdRp- und N-Gen) betrug 87,6 % und der ORF1a/b-Gen-Ct-Wert des Sansure Biotech 2019-nCoV-Tests zeigte, dass der Prozentsatz des niedrigen Ct-Werts (< 20 Ct) 50,3 % und der hohe Ct-Wert (36–40 Ct) 3,2 % betrug.Wie in Abb. gezeigt.Am 1. Januar 2019 ergab die Analyse von Abbott SARS-CoV-2 (kombiniertes Gen RdRp und N) mit 87,6 % eine Ct-Analyse (< 20 Ct) von Sansure Biotech 2019-nCoV wurde vor einem Jahr getestet Der niedrigste Ct-Wert (< 20 Ct) betrug 50,3 %, der niedrige Ct-Wert (36–40 Ct) betrug 3,2 %. 1. Der Prozentsatz der Analyse des niedrigsten Ct-Werts (< 20 Ct) von Abbott SARS-CoV-2 (kombiniertes Gen RdRp und N) betrug 87,6 %, und der Ct-Wert der ORF1a/b-Genanalyse von Sansure Biotech 2019-nCoV zeigte, dass der Prozentsatz des niedrigen Ct-Werts (< 20 Ct) 50,3 % und der des hohen Ct-Werts (36–40 Ct) 3,2 % betrug.1 Jahr, Abbott SARS-CoV-2-Test (RdRp 和N 基因) mit durchschnittlichem CT-Wert (< 20 CT) bei 87,6 % von Sansure Biotech 2019-nCoV hat eine ORF1a/b-Konzentration von 50,3 % (< 20 ct) erhalten. Der Wert liegt bei 3,2 %. Wie in Abbildung 1 dargestellt, beträgt der niedrigste Ct-Wert (< 20 Ct) des Abbott SARS-CoV-2-Tests (Kombination aus RdRp- und N-Gen) 87,6 %, der ORF1a/b-Gen-Ct-Wert des Sansure Biotech 2019-nCoV-Tests zeigt einen niedrigen Ct-Wert (< 20 Ct), der Prozentsatz beträgt 50,3 %, der Ct-Wert (36–40 Ct) beträgt 3,2 %. Als Antwort auf Risiko 1 analysierte Abbott SARS-CoV-2 (gezüchtete RdRp- und N-Gene) mit einem ebenso niedrigprozentigen Ct-Wert (< 20 Ct) im Bereich von 87,6 % Veröffentlichung von Ct Gen ORF1a/b in der Folge Sansure Biotech 2019 – Die nCoV-Analyse wurde von Ct. Wie in Abbildung 1 dargestellt, hatte der Abbott SARS-CoV-2-Test (Kombination der RdRp- und N-Gene) mit 87,6 % den niedrigsten prozentualen Ct-Wert (< 20 Ct), während der Ct-Wert des ORF1a/b-Gens in der Sansure Biotech-Studie 2019 – Die Analyse von nCoV zeigte einen niedrigen Ct-Wert. Der Goldgehalt (< 20 Ct) beträgt 50,3 %, der Goldgehalt (36–40 Ct) beträgt 3,2 %. Der Anteil der Werte (< 20 Ct) lag bei 50,3 %, der Anteil der hohen Ct-Werte (36–40 Ct) bei 3,2 %.Der Abbott SARS-CoV-2 B-Test verzeichnete Ct-Werte über 30. Andererseits hatte das ORF1a/b-Gen beim BGI SARS-CoV-2-Test einen hohen Ct-Wert (> 36 Ct), der Prozentsatz betrug 4 % (Abb. 1). Andererseits hatte das ORF1a/b-Gen beim BGI SARS-CoV-2-Test einen hohen Ct-Wert (> 36 Ct), der Prozentsatz betrug 4 % (Abb. 1). Bei der Analyse des BGI SARS-CoV-2-Gens ORF1a/b wurde in anderen Fällen ein Ct-Wert (> 36 Ct) mit einem Wert von 4 % ermittelt (Risk. 1). Andererseits wies das SARS-CoV-2-Gen ORF1a/b bei der Analyse des BGI einen hohen Ct-Wert (> 36 Ct) auf, dessen Prozentsatz 4 % betrug (Abb. 1).Derzeit beträgt die Konzentration von BGI SARS-CoV-2 und ORF1a/b etwa 4 % (ca. 1 %). Andererseits beträgt beim BGI-SARS-CoV-2-Nachweis der Prozentsatz des ORF1a/b-Gens mit hohem Ct-Wert (>36 Ct) 4 % (Abbildung 1). Bei der Analyse des BGI-SARS-CoV-2-Genoms ORF1a/b mit ausgewählten Ct-Werten (>36 Ct) lag der Wert bei 4 % (Risk. 1). In der BGI SARS-CoV-2-Analyse hingegen lag der Anteil der ORF1a/b-Gene mit hohen Ct-Werten (>36 Ct) bei 4 % (Abb. 1).
Im Rahmen dieser Studie wurden 164 Nasen-Rachen-Proben entnommen. Für alle Testarten wurde die RNA-Isolierung und -Amplifikation mit den von den jeweiligen Herstellern empfohlenen Methoden und Kits durchgeführt.
Diese Studie hat gezeigt, dass der Test von Abbott für SARS-CoV-2 die gleiche Nachweisleistung wie CRS aufweist, mit 100 % positiver, negativer und allgemeiner Übereinstimmung. Die Kappa-Übereinstimmung nach Cohen beträgt 1,00 und weist auf eine vollständige Übereinstimmung mit CRS hin. Eine ähnliche Studie der University of Washington in den USA hat ergeben, dass die Gesamtsensitivität und -spezifität des Abbott-Tests für SARS-CoV-2 93 % bzw. 100 % betrug, verglichen mit dem laborbestimmten Test (LDA) der CDC. 11. Das SARS-CoV-2-Nachweissystem von Abbott basiert auf dem gleichzeitigen kombinierten Nachweis der Gene N und RdRp, da beide Gene sensitiver sind und so falsch-negative Ergebnisse minimiert werden12. Eine Studie in Wien, Österreich, hat auch gezeigt, dass große Extraktionsprobenvolumina und Detektionselentenvolumina Verdünnungseffekte minimierten und die Nachweiseffizienz erhöhten13. Daher kann Abbotts perfekter Test für SARS-CoV-2 mit einem Plattform-Erkennungssystem verknüpft werden, das gleichzeitig kombinatorische Gene erkennt, eine große Anzahl von Proben (0,5 ml) extrahiert und eine große Menge Eluent (40 µl) verwendet.
Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass die Nachweisleistung des Daan-Gentests nahezu identisch mit der des CRS war. Dies steht im Einklang mit einer Studie14 der Anhui-Universität in Huainan, China, und der Herstelleraussage einer 100%igen positiven Übereinstimmung. Trotz Berichten über übereinstimmende Ergebnisse war eine Probe nach erneuter Prüfung desselben Eluats falsch negativ, jedoch positiv in den Tests von Abbott SARS-CoV-2 und Sansure Biotech nCoV-2019. Dies deutet darauf hin, dass die Ergebnisse bei verschiedenen Testarten variieren können. Dennoch unterschied sich das Ergebnis des Daan-Gentests in der in China15 durchgeführten Studie signifikant (p < 0,05) von dem im Labor definierten Referenztest. Dennoch unterschied sich das Ergebnis des Daan-Gentests in der in China15 durchgeführten Studie signifikant (p < 0,05) von dem im Labor definierten Referenztest. In den letzten 15 Jahren wurde die Analyse von Daan Gene von einer Laboranalyse positiv bewertet (p < 0,05). In einer Studie in China15 unterschied sich das Analyseergebnis von Daan Gene jedoch signifikant (p < 0,05) von ihrer Laborreferenzanalyse.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（S < 0,05）。然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Laut einer Studie, die in China nachgewiesen wurde, ergaben 15 Ergebnisse, dass der genetische Test von Daan aufgrund seiner Etablierung positiv bewertet wurde (p < 0,05). laboratornym Testom. In einer Studie in China15 unterschieden sich die Ergebnisse des Gentests von Daan jedoch signifikant (p < 0,05) von denen des Referenzlabortests.Diese Diskrepanz kann auf die Empfindlichkeit des Referenztests zum Nachweis von SARS-CoV-2 zurückzuführen sein. Zur Ermittlung der Ursache könnten weitere Studien wichtig sein.
Darüber hinaus bewertete unsere Studie die vergleichende Leistung des SARS-CoV-2-BGI-Tests mit CRS und zeigte eine ausgezeichnete positive prozentuale Übereinstimmung (PPA = 97,9 %), negative prozentuale Übereinstimmung (NPA = 100 %) und Gesamtprozentübereinstimmung nach Geschlecht (OPA). = 98,8 %). Cohens Kappa-Werte zeigten eine gute Übereinstimmung (K = 0,975). Studien in den Niederlanden16 und China15 haben konsistente Ergebnisse gezeigt. Der SARS-CoV-2-BGI-Test ist ein Einzelgen-(ORF1a/b)-Nachweistest unter Verwendung von 10 µl Amplifikations-/Nachweiseluat. Trotz guter statistischer Übereinstimmung mit unseren Referenzergebnissen übersah die Analyse zwei positive Proben (1,22 %) der Gesamtprobe. Dies kann enorme klinische Auswirkungen auf die Übertragungsdynamik sowohl auf Patienten- als auch auf Gemeinschaftsebene haben.
Eine weitere vergleichende Analyse dieser Studie betraf den Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO)-Test; die Gesamtübereinstimmungsquote lag bei 96,3 %. Die Übereinstimmung wurde auch anhand des Cohen-Kappa-Werts bestimmt, der 0,925 betrug und eine vollständige Übereinstimmung mit dem CRS anzeigte. Auch hier stimmen unsere Ergebnisse mit Studien überein, die an der Central South University in Changsha, China, und in der Abteilung für klinische Labore des Liuzhou People's Hospital in Liuzhou, China, durchgeführt wurden17. Obwohl die oben genannte gute statistische Übereinstimmung festgestellt wurde, zeigte der Chi-Quadrat-Test (MacNemar-Test), dass das Ergebnis des Sansure Biotech-Tests einen statistisch signifikanten Unterschied zum CRS aufwies (p < 0,005). Obwohl die oben genannte gute statistische Übereinstimmung festgestellt wurde, zeigte der Chi-Quadrat-Test (MacNemar-Test), dass das Ergebnis des Sansure Biotech-Tests einen statistisch signifikanten Unterschied zum CRS aufwies (p < 0,005). Darüber hinaus wurde das Kriterium „Makro-Kriterium“ (Kriterium „Maknemar“), das eine sehr gute statistische Analyse darstellt, bestätigt Ergebnis Die Analyse von Sansure Biotech weist eine herausragende statistische Analyse nach CRS auf (p < 0,005). Obwohl die oben beschriebene gute statistische Übereinstimmung festgestellt wurde, zeigte der Chi-Quadrat-Test (McNemar-Test), dass das Ergebnis des Sansure Biotech-Tests einen statistisch signifikanten Unterschied zum CRS aufwies (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性, 但卡方检验 (MacNemar 检验）表明, Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异（p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性, 但 检验 (（（macnemar 检验 表明), Sansure Biotech 检测 结果 与 crs相比 具有 显着 ((p <0,005). Als Ergebnis einer sehr guten statistischen Analyse hat mir das Kriterium „Makro“ eine statistische Bewertung (S. <) angezeigt 0,005) Zwischenanalyse von Sansure Biotech und CRS. Trotz der oben erwähnten guten statistischen Übereinstimmung zeigte der Chi-Quadrat-Test (McNemar-Test) einen statistisch signifikanten Unterschied (p < 0,005) zwischen dem Sansure Biotech-Test und dem CRS.Sechs Proben (3,66 %) erwiesen sich im Vergleich zum CRS als falsch negativ (Ergänzende Tabelle 1); dies ist insbesondere angesichts der Dynamik der Virusübertragung von großer Bedeutung. Die oben genannten Daten stützen auch diese niedrige Nachweisrate15.
In dieser Studie wurden die Ct-Werte für jeden Test und die jeweilige Plattform ermittelt, wobei der niedrigste mittlere Ct-Wert im Abbott SARS-CoV-2-Test gemeldet wurde. Dieses Ergebnis könnte mit Abbotts simultanem kombinierten genetischen Testsystem zum Nachweis von SARS-CoV-2 zusammenhängen. Daher wiesen laut Abbildung 1 87,6 % der Abbott SARS-CoV-2-Ergebnisse Ct-Werte unter 20 auf. Nur eine kleine Anzahl von Probenergebnissen (12,4 %) lag im Bereich von 20 bis 30. Ct-Werte über 30 wurden nicht erfasst. Zusätzlich zur Verwendung des SARS-CoV-2-Panel-Gentestformats durch Abbott könnte dieses Ergebnis mit der unteren Nachweisgrenze (32,5 RNA-Kopien/ml)18 zusammenhängen, die dreimal niedriger ist als die vom Unternehmen angegebene Untergrenze von 100 RNA-Kopien/ml)19.
Diese Studie weist einige Einschränkungen auf: Erstens verfügen wir aufgrund fehlender Ressourcen nicht über Standard-/Referenzmethoden [wie Viruslast oder andere Labortests (LDA)]. Zweitens handelte es sich bei allen in dieser Studie verwendeten Proben um Nasen-Rachen-Abstriche, wobei die Ergebnisse nicht auf andere Probentypen übertragbar waren, und drittens war unsere Stichprobengröße gering.
In dieser Studie wurde die Leistung von vier rRT-PCR-Tests für SARS-CoV-2 anhand von Nasen-Rachen-Proben verglichen. Mit Ausnahme des Tests von Sansure Biotech zeigten alle Nachweistests eine nahezu vergleichbare Leistung. Außerdem wurde im Sansure Biotech-Test im Vergleich zum CRS eine niedrige Positivitätsrate festgestellt (p < 0,05). Außerdem wurde im Sansure Biotech-Test im Vergleich zum CRS eine niedrige Positivitätsrate festgestellt (p < 0,05). Darüber hinaus erzielte Sansure Biotech im Test nur wenige Prozent mehr Ergebnisse als CRS (p < 0,05). Darüber hinaus zeigte der Sansure Biotech-Test im Vergleich zu CRS einen geringeren Prozentsatz positiver Ergebnisse (p < 0,05).Nach Angaben der CRS-Studie hat Sansure Biotech eine neue Studie durchgeführt (p < 0,05).Nach Angaben der CRS-Studie hat Sansure Biotech eine neue Studie durchgeführt (p < 0,05). Darüber hinaus analysierte Sansure Biotech mehr als ein Dutzend neue Ergebnisse mit CRS (p < 0,05). Darüber hinaus wies der Test von Sansure Biotech im Vergleich zu CRS eine niedrigere Positivitätsrate auf (p < 0,05).Die Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO)-Analyse von PPA, NPA und Gesamtübereinstimmung übertraf 93,5 % mit einem Cohen-Kappa-Übereinstimmungswert von 0,925. Schließlich bedarf der Sansure Biotech Assay (RUO) für den Einsatz in Äthiopien einer weiteren Validierung, und es sollten zusätzliche Untersuchungen in Betracht gezogen werden, um die Aussagen einzelner Hersteller zu bewerten.
Das vergleichende Studiendesign wurde in vier Gesundheitseinrichtungen in Addis Abeba durchgeführt: Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treatment Centre, Zewooditu Memorial Hospital und St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. Die Daten wurden zwischen dem 1. und 31. Dezember 2020 erhoben. Die medizinischen Einrichtungen für diese Studie wurden bewusst aufgrund ihrer hohen Fallzahl und der Verfügbarkeit größerer Behandlungszentren in der Stadt ausgewählt. Ebenso wurden Instrumente, darunter die Echtzeit-PCR-Instrumente ABI 7500 und Abbott m2000, gemäß den Empfehlungen der NAAT-Reagenzienhersteller ausgewählt, und vier PCR-Nachweiskits wurden für diese Studie ausgewählt, da die meisten Labore in Äthiopien mindestens vier davon verwendeten (Gentest, Abbott SARS-CoV-2-Test, Sansure Biotech-Test und SARS-CoV-2 BGI-Test während der Studie durchgeführt).
Vom 1. bis 30. Dezember 2020 wurden Tests auf SARS-CoV-2 mit 3 ml Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) bei Personen durchgeführt, die auf COVID-19 untersucht und an das EPHI überwiesen wurden. Nasopharyngeale Proben wurden von geschulten Probensammlern entnommen und in Dreierpackungen an das EPHI geschickt. Vor der Nukleinsäureisolierung wird jeder Probe eine eindeutige Identifikationsnummer zugewiesen. Die Extraktion wird aus jeder Probe sofort nach dem Eintreffen mit manuellen und automatischen Extraktionsmethoden durchgeführt. So wurden für die automatische Extraktion von Abbott m2000 1,3 ml (einschließlich 0,8 ml Totvolumen und 0,5 ml Extraktionseinlassvolumen) der Probe aus jeder Probe extrahiert und durch das Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA) geleitet. ) Eine Charge von 96 [92 Proben, zwei Detektionskontrollen und zwei Nicht-Template-Kontrollen (NTC)] wurde in den Gesamtprozess (Abruf und Erkennung) von zwei Runden SARS-CoV-2 (EUA) in Echtzeit-Mining einbezogen. Ebenso wurden für die manuelle Extraktion dieselben Proben verwendet (für automatische Extraktion und Erkennung). Daher wurden während des gesamten Prozesses 140-µl-Proben aliquotiert und mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) in Chargen von 24 (darunter 20 Proben, zwei Testkontrollen und zwei NTCs) über neun Runden extrahiert. Manuell extrahierte Eluate wurden amplifiziert und mit einem ABI 7500-Thermocycler unter Verwendung des SARS-CoV-2 BGI-Assays, des Daan Gene-Assays und des Sansure Biotech-Assays erkannt.
Die automatisierte Isolierung und Reinigung viraler RNA von SARS-CoV-2 erfolgt nach dem Prinzip magnetischer Perlen unter Verwendung von Reagenzien zur DNA-Probenvorbereitung von Abbott. Die Inaktivierung der Proben und Solubilisierung viraler Partikel erfolgt mit einem Guanidinisothiocyanat-haltigen Detergenz, um das Protein zu denaturieren und RNase zu inaktivieren. Die RNA wird dann durch Festphasentrennung mit Silica vom Protein getrennt, d. h. das Guanidiniumsalz und der alkalische pH-Wert des Lysepuffers fördern die Bindung der Nukleinsäuren an das Silica (SiO2). Der Spülschritt entfernt verbleibende Proteine ​​und Ablagerungen, um eine klare Lösung zu erzeugen. Transparente RNA wird mithilfe des Magnetfelds des Geräts aus Mikropartikeln auf Silicabasis isoliert20,21. Die manuelle Isolierung und Reinigung von RNA erfolgt hingegen mit der Spin-Säulen-Methode unter Verwendung von Zentrifugation anstelle eines Magnetständers und Trennung der Mikropartikel vom Eluenten.
Der Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, der von der WHO und FDA die EUA19,22 erhielt. In diesem Protokoll wurde die Probeninaktivierung vor der Extraktion 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 56 °C durchgeführt. Nach der Virusinaktivierung wurde die Nukleinsäureextraktion aus 0,5 ml VTM auf einem Abbott m2000 SP-Gerät unter Verwendung eines Abbott m2000 DNA-Probenvorbereitungssystems durchgeführt. gemäß Hersteller. Amplifikation und Detektion wurden mit einem Abbott m2000 RT-PCR-Gerät durchgeführt und für die Gene RdRp und N wurde eine duale Detektion durchgeführt. ROX) und VIC P (proprietärer Farbstoff) zum Targeting und zur Detektion interner Kontrollen, was eine gleichzeitige Detektion beider Amplifikationsprodukte ermöglicht 19 .
Die Amplifikationsnachweismethode dieses Kits basiert auf der einstufigen RT-PCR-Technologie. Die ORF1a/b- und N-Gene wurden von Daan Gene Technology als konservierte Regionen ausgewählt, um die Amplifikation der Zielregion nachzuweisen. Spezifische Primer und Fluoreszenzsonden (N-Gensonden markiert mit FAM, ORF1a/b-Sonden markiert mit VIC) wurden entwickelt, um SARS-CoV-2-RNA in Proben nachzuweisen. Der finale Eluent und die Mastermixe wurden durch Zugabe von 5 µl Eluent zu 20 µl Mastermix auf ein Endvolumen von 25 µl hergestellt. Amplifikation und Nachweis wurden gleichzeitig auf einem ABI 750024 Echtzeit-PCR-Gerät durchgeführt.
Die ORF1a/b- und N-Gene wurden mit dem Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (Fluoreszenz-PCR-Detektion) nachgewiesen. Bereiten Sie spezifische Sonden für jedes Zielgen vor, indem Sie den FAM-Kanal für die ORF1a/b-Region und den ROX-Kanal für das N-Gen auswählen. Zu diesem Testkit werden Eluent und Mastermix-Reagenzien wie folgt hinzugefügt: Bereiten Sie 30 µl Mastermix-Reagenz und 20 µl eluierte Probe zur Detektion/Amplifikation vor. Zur Amplifikation/Detektion wurde die Echtzeit-PCR ABI 750025 verwendet.
Der SARS-CoV-2 BGI-Test ist ein fluoreszierendes Echtzeit-rRT-PCR-Kit zur Diagnose von COVID-19. Die Zielregion befindet sich in der ORF1a/b-Region des SARS-CoV-2-Genoms und ist eine Einzelgen-Nachweismethode. Zusätzlich ist das menschliche Housekeeping-Gen β-Actin ein intern reguliertes Zielgen. Der Mastermix wird durch Mischen von 20 µl des Mastermix-Reagenzes und 10 µl der extrahierten RNA-Probe in einer Mikrotiterplatte hergestellt26. Für Amplifikation und Detektion wurde ein ABI 7500 Fluoreszenz-quantitatives Echtzeit-PCR-Gerät verwendet. Die gesamte Nukleinsäureamplifikation, die PCR-Laufbedingungen für jeden Test sowie die Ergebnisinterpretation erfolgten gemäß den jeweiligen Herstelleranweisungen (Tabelle 3).
In dieser vergleichenden Analyse haben wir nicht die Referenzstandardmethode verwendet, um die prozentuale Übereinstimmung (positiv, negativ und gesamt) und andere Vergleichsparameter für die vier Analysen zu bestimmen. Jeder Testvergleich wurde mit CRS durchgeführt. In dieser Studie wurde der CRS durch die Regel „jedes Positiv“ festgelegt und das Ergebnis wurde nicht durch einen einzelnen Test ermittelt. Wir haben mindestens zwei übereinstimmende Testergebnisse verwendet. Außerdem sind im Falle einer COVID-19-Übertragung falsch negative Ergebnisse gefährlicher als falsch positive Ergebnisse. Um daher aufgrund eines CRS-Ergebnisses möglichst genau „positiv“ sagen zu können, müssen mindestens zwei Testtests positiv sein, d. h., dass mindestens ein positives Ergebnis wahrscheinlich aus einem EUA-Test stammen muss. Daher werden von vier Testergebnissen zwei oder mehr Testergebnisse, die das gleiche Ergebnis liefern, als richtig positiv oder richtig negativ angesehen18,27.
Die Datenerhebung erfolgte mithilfe strukturierter Datenextraktionsformulare. Die Dateneingabe und -analyse erfolgte mit der Statistiksoftware Excel und SPSS Version 23.0 für deskriptive Statistik. Positive, negative und allgemeine prozentuale Übereinstimmung wurden analysiert. Der Grad der Übereinstimmung jeder Methode mit CRS wurde anhand eines Kappa-Scores bestimmt. Kappa-Werte werden wie folgt interpretiert: 0,01 bis 0,20 für leichte Übereinstimmung, 0,21 bis 0,40 für allgemeine Übereinstimmung, 0,41–0,60 für mäßige Übereinstimmung, 0,61–0,80 für große Übereinstimmung und 0,81–0,99 für vollständige Übereinstimmung28.
Die Universität Addis Abeba erteilte die ethische Freigabe, und alle Versuchsprotokolle dieser Studie wurden vom wissenschaftlichen Ethikausschuss des äthiopischen Gesundheitsinstituts (EPHI) genehmigt. Die Referenznummer der EPHI-Ethiklizenz lautet EPHI/IRB-279-2020. Alle Methoden wurden gemäß den Empfehlungen und Bestimmungen der äthiopischen nationalen umfassenden Richtlinien zur Behandlung von COVID-19 angewendet. Darüber hinaus wurde von allen Studienteilnehmern vor der Teilnahme an der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
Alle im Rahmen dieser Studie gewonnenen oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten. Daten, die die Ergebnisse dieser Studie belegen, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.
Weltgesundheitsorganisation. Empfehlungen für Laborteststrategien für COVID-19: Vorläufige Leitlinien, 21. März 2020 Nr. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
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