Durchführung von vier Nukleinsäureamplifikationstests zur Identifizierung von SARS-CoV-2 in Äthiopien

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Seit dem Ausbruch der Coronavirus-Krankheit (COVID-19) im Jahr 2019 wurden weltweit viele kommerzielle Nukleinsäureamplifikationstests (NAATs) entwickelt und sind zu Standardtests geworden. Obwohl schnell mehrere Tests entwickelt und auf Labordiagnostiktests angewendet wurden, wurde die Leistung dieser Tests in verschiedenen Umgebungen nicht evaluiert. Daher zielte diese Studie darauf ab, die Leistung der Abbott SARS-CoV-2-, Daan Gene-, BGI- und Sansure Biotech-Assays unter Verwendung des Composite Reference Standard (CRS) zu bewerten. Die Studie wurde vom 1. bis 30. Dezember 2020 am Äthiopischen Public Health Institute (EPHI) durchgeführt. 164 nasopharyngeale Proben wurden mit dem QIAamp RNA Mini Kit und dem Abbott DNA-Probenvorbereitungssystem extrahiert. Von 164 Proben waren 59,1 % positiv und 40,9 % negativ für CRS. Die Positivität von Sansure Biotech war im Vergleich zu CRS signifikant niedrig (p < 0,05). Die Positivität von Sansure Biotech war im Vergleich zu CRS signifikant niedrig (p < 0,05). Die neuesten Ergebnisse von Sansure Biotech wurden erst kürzlich mit CRS bewertet (p < 0,05). Die positiven Ergebnisse von Sansure Biotech waren im Vergleich zu CRS deutlich geringer (p < 0,05).与CRS-Bericht, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）.与CRS-Bericht, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）. Bei Sansure Biotech wurden mehrere zusätzliche Ergebnisse nach CRS ermittelt (p < 0,05). Sansure Biotech hatte im Vergleich zu CRS deutlich weniger positive Ergebnisse (p < 0,05).Die Gesamtübereinstimmung der vier Analysen betrug 96,3–100 % im Vergleich zum CRS. Zusätzlich zur niedrigen Positivitätsrate des Sansure Biotech-Assays war die Leistung der vier Assays nahezu vergleichbar. Daher erfordert der Sansure Biotech [Research Only (RUO)]-Assay für seine Verwendung in Äthiopien eine zusätzliche Validierung. Schließlich sollten zusätzliche Untersuchungen in Betracht gezogen werden, um Tests mit entsprechenden Herstellerangaben zu bewerten.
Labortests sind Teil des Strategischen Plans zur Vorbereitung und Reaktion auf die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) (SPRP) der Weltgesundheitsorganisation (WHO). Die WHO weist darauf hin, dass die Länder Laborkapazitäten aufbauen müssen, um die Vorbereitung, das ordnungsgemäße Fallmanagement, die Wachsamkeit und die schnelle Reaktion auf Herausforderungen im Bereich der öffentlichen Gesundheit zu verbessern. Dies legt nahe, dass die Rolle des Labors von entscheidender Bedeutung für die Charakterisierung der Krankheit und Epidemiologie neu auftretender Infektionserreger und die Kontrolle ihrer Ausbreitung ist.
Für die Diagnose von COVID-19 sind epidemiologische und medizinische Informationen, persönliche Symptome/Anzeichen sowie Röntgen- und Labordaten erforderlich2. Seit der COVID-19-Ausbruch in Wuhan, China, gemeldet wurde, wurden weltweit viele kommerzielle Nukleinsäureamplifikationstests (NAATs) entwickelt. Die Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (rRT-PCR) wird als Routine- und Standardmethode für die Labordiagnose einer Infektion mit dem schweren akuten respiratorischen Syndrom 2 (SARS-CoV-2)3 verwendet. Der molekulare Nachweis von SARS-CoV-2 basiert typischerweise auf den Genen N (Nukleokapsidprotein-Gen), E (Hüllprotein-Gen) und RdRp (RNA-abhängiges RNA-Polymerase-Gen) in ORF1a/b (offener Leserahmen 1a/b). . Genregion, die aus dem viralen Genom identifiziert wurde. Sie gelten als die wichtigsten konservierten Regionen im Virusgenom für die Viruserkennung4. Unter diesen Genen weisen die RdRp- und E-Gene eine hohe analytische Nachweisempfindlichkeit auf, während das N-Gen eine niedrige analytische Nachweisempfindlichkeit aufweist5.
Die Leistung von PCR-Assays kann abhängig von verschiedenen Faktoren variieren, wie z. B. Extraktionsreagenzien, Amplifikations-/Nachweisreagenzien, Extraktionsmethode, Qualität des PCR-Geräts und anderer Instrumente. Bis April 2020 haben mehr als 48 verschiedene Diagnosegeräte aus neun Ländern eine Notfallzulassung (EUA) für die COVID-196-Diagnostik erhalten. In Äthiopien werden mehr als 14 Echtzeit-PCR-Plattformen für den PCR-Nachweis von SARS-CoV-2 in 26 öffentlichen Gesundheitseinrichtungen verwendet, darunter ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 und Quant-studio7. Darüber hinaus sind verschiedene PCR-Testkits erhältlich, wie der Daan-Gentest, der Abbott SARS-CoV-2-Test, der Sansure Biotech-Test und der SARS-CoV-2-BGI-Test. Obwohl die rRT-PCR hochempfindlich ist, melden einige Patienten mit COVID-19 falsch negative Ergebnisse aufgrund unzureichender Kopien der viralen Ribonukleinsäure (RNA) in den Proben aufgrund unsachgemäßer Sammlung, Transport, Lagerung und Handhabung sowie Labortests. Bedingungen und Handlungen des Personals8. Darüber hinaus können unsachgemäße Handhabung von Proben oder Kontrollen, die Einstellung des Zyklusschwellenwerts (Ct) und Kreuzreaktivität mit anderen pathogenen Nukleinsäuren oder inaktiver/restlicher SARS-CoV-2-RNA zu falsch positiven Ergebnissen in rRT-PCR9-Assays führen. Somit ist klar, dass PCR-Tests tatsächlich Träger von Genfragmenten identifizieren können, da sie nicht einmal zwischen wirklich aktiven viralen Genen unterscheiden können, sodass die Tests nur Träger und keine Patienten identifizieren können10. Daher ist es wichtig, die diagnostische Leistung mithilfe von Standardmethoden in unserem Umfeld zu beurteilen. Obwohl viele NAAT-Reagenzien am Äthiopischen Institut für öffentliche Gesundheit (EPHI) und im ganzen Land erhältlich sind, wurde noch keine vergleichende Bewertung ihrer Wirksamkeit veröffentlicht. Daher zielte diese Studie darauf ab, die vergleichende Leistung kommerziell erhältlicher Kits zum Nachweis von SARS-CoV-2 mittels rRT-PCR unter Verwendung klinischer Proben zu bewerten.
Insgesamt wurden 164 Teilnehmer mit Verdacht auf COVID-19 in diese Studie einbezogen. Der Großteil der Proben stammte aus Behandlungszentren (118/164 = 72 %), während die restlichen 46 (28 %) Teilnehmer aus Nicht-Behandlungszentren stammten. Von den Teilnehmern, die nicht im Zentrum behandelt wurden, hatten 15 (9,1 %) klinisch vermutete Fälle und 31 (18,9 %) hatten Kontakte zu bestätigten Fällen. Dreiundneunzig (56,7 %) Teilnehmer waren männlich und das Durchschnittsalter (± SD) der Teilnehmer betrug 31,10 (± 11,82) Jahre.
In dieser Studie wurden Positiv- und Negativraten von vier Tests auf COVID-19 ermittelt. Somit betrugen die positiven Raten des Abbott SARS-CoV-2-Assays, des Daan Gene 2019-nCoV-Assays, des SARS-CoV-2 BGI-Assays und des Sansure Biotech 2019-nCoV-Assays 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % bzw. 55,5 % . Die positiven und negativen CRS-Werte (Composite Reference Standard) betrugen 97 (59,1 %) bzw. 67 (40,9 %) (Tabelle 1). In dieser Studie basierte die Definition von CRS auf der „jedes positive“-Regel, wonach von vier Testergebnissen zwei oder mehr Testergebnisse, die das gleiche Ergebnis ergaben, als richtig positiv oder negativ angesehen wurden.
In dieser Studie fanden wir für alle Analysen im Vergleich zu CRS eine negative prozentuale Übereinstimmung (NPA) von 100 % (95 %-KI 94,6–100). Die Sansure Biotechnology-Analyse zeigte einen minimalen PPA von 93,8 % (95 %-KI 87,2–97,1) und die Daan Gene 2019-nCoV-Analyse wies eine Gesamtübereinstimmung von 99,4 % (95 %-KI 96,6–99,9) auf. Im Gegensatz dazu betrug die Gesamtübereinstimmung zwischen dem SARS-CoV-2-BGI-Assay und dem Sansure Biotech 2019-nCoV-Assay 98,8 % bzw. 96,3 % (Tabelle 2).
Der Kappa-Übereinstimmungskoeffizient von Cohen zwischen den Ergebnissen des CRS- und Abbott SARS-CoV-2-Tests war vollständig konsistent (K = 1,00). In ähnlicher Weise stimmen auch die von Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI und Sansure Biotech 2019-nCoV ermittelten Kappa-Werte von Cohen vollständig mit CRS überein (K ≥ 0,925). In dieser vergleichenden Analyse zeigte der Chi-Quadrat-Test (McNemar-Test), dass sich die Ergebnisse des Sansure Biotech 2019-nCoV-Tests deutlich von den CRS-Ergebnissen unterschieden (p = 0,031) (Tabelle 2).
Wie in Abb.1 Der Prozentsatz des niedrigsten Ct-Werts (< 20 Ct) des Abbott SARS-CoV-2-Assays (kombiniertes RdRp- und N-Gen) betrug 87,6 %, und der Ct-Wert des ORF1a/b-Gens des Sansure Biotech 2019-nCoV-Assays zeigte, dass der Prozentsatz niedrig war Der Ct-Wert (< 20 Ct) betrug 50,3 % und der hohe Ct-Wert (36–40 Ct) betrug 3,2 %. 1 Der Prozentsatz des niedrigsten Ct-Werts (< 20 Ct) des Abbott SARS-CoV-2-Assays (kombiniertes RdRp- und N-Gen) betrug 87,6 %, und der Ct-Wert des ORF1a/b-Gens des Sansure Biotech 2019-nCoV-Assays zeigte, dass der Prozentsatz niedrig war Der Ct-Wert (< 20 Ct) betrug 50,3 % und der hohe Ct-Wert (36–40 Ct) betrug 3,2 %.Wie in Abb.Am 1. Januar 2019 ergab die Analyse von Abbott SARS-CoV-2 (kombiniertes Gen RdRp und N) mit 87,6 % eine Ct-Analyse (< 20 Ct) von Sansure Biotech 2019-nCoV erreichte bei einem Testergebnis von 50,3 % den niedrigsten Ct-Wert (< 20 Ct), während der Ct-Wert (36–40 Ct) bei 3,2 % lag. 1 betrug der Prozentsatz des niedrigsten Ct-Werts (< 20 Ct) bei der Analyse von Abbott SARS-CoV-2 (kombiniertes Gen RdRp und N) 87,6 %, und der Ct-Wert der ORF1a/b-Genanalyse von Sansure Biotech 2019-nCoV ergab dass der Prozentsatz des niedrigen Ct-Werts (< 20 Ct) 50,3 % und der des hohen Ct-Werts (36–40) ausmachte Ct) machte 3,2 % aus.1 Jahr, Abbott SARS-CoV-2-Test (RdRp 和N 基因) mit durchschnittlichem CT-Wert (< 20 CT) bei 87,6 % von Sansure Biotech 2019-nCoV hat eine ORF1a/b-Konzentration von 50,3 % (< 20 ct) erhalten. Der Wert liegt bei 3,2 %. Wie in Abbildung 1 dargestellt, beträgt der niedrigste Ct-Wert-Prozentsatz (< 20 Ct) des Abbott SARS-CoV-2-Tests (Kombination aus RdRp und N-Gen) 87,6 %, der ORF1a/b-Gen-Ct-Wert des Sansure Biotech 2019-nCoV-Tests zeigt einen niedrigen Ct值(< 20 Ct) 的-Prozentsatz beträgt 50,3 %, 高Ct Der Anteil von 值(36–40 Ct) 的 beträgt 3,2 %. Als Antwort auf Risiko 1 analysierte Abbott SARS-CoV-2 (gezüchtete RdRp- und N-Gene) mit einem ebenso niedrigprozentigen Ct-Wert (< 20 Ct) im Bereich von 87,6 % Ct-Gen ORF1a/b in der Sansure Biotech 2019-Analyse von nCoV wurde von Ct veröffentlicht. Wie in Abbildung 1 dargestellt, wies der Abbott SARS-CoV-2-Assay (der die RdRp- und N-Gene kombiniert) mit 87,6 % den niedrigsten prozentualen Ct-Wert (< 20 Ct) auf, während der Ct-Wert des ORF1a/b-Gens im Sansure Biotech-Studie 2019 – Die Analyse von nCoV ergab einen niedrigen Ct. Der Goldgehalt (< 20 Ct) beträgt 50,3 %, der Goldgehalt (36–40 Ct) beträgt 3,2 %. Der Anteil der Werte (< 20 Ct) betrug 50,3 %, der Anteil der hohen Ct-Werte (36–40 Ct) betrug 3,2 %.Der Abbott SARS-CoV-2 B-Test ergab Ct-Werte über 30. Andererseits hatte das ORF1a/b-Gen im BGI SARS-CoV-2-Assay einen hohen Ct-Wert (> 36 Ct), der Prozentsatz betrug 4 % (Abb. 1). Andererseits hatte das ORF1a/b-Gen im BGI SARS-CoV-2-Assay einen hohen Ct-Wert (> 36 Ct), der Prozentsatz betrug 4 % (Abb. 1). Bei der Analyse des BGI SARS-CoV-2-Gens ORF1a/b wurde in anderen Fällen ein Ct-Wert (> 36 Ct) mit einem Wert von 4 % ermittelt (Risk. 1). Andererseits wies bei der Analyse des BGI-SARS-CoV-2-Gens ORF1a/b ein hoher Ct-Wert (> 36 Ct) auf, dessen Prozentsatz 4 % betrug (Abb. 1).Derzeit beträgt die Konzentration von BGI SARS-CoV-2 und ORF1a/b etwa 4 % (ca. 1 %). Andererseits beträgt beim BGI SARS-CoV-2-Nachweis der Prozentsatz des ORF1a/b-Gens mit hohem Ct-Wert (>36 Ct) 4 % (Abbildung 1). Bei der Analyse des BGI-SARS-CoV-2-Genoms ORF1a/b mit ausgewählten Ct-Werten (>36 Ct) lag der Wert bei 4 % (Risk. 1). Andererseits betrug in der BGI SARS-CoV-2-Analyse der Anteil der ORF1a/b-Gene mit hohen Ct-Werten (>36 Ct) 4 % (Abb. 1).
In dieser Studie haben wir 164 Nasopharynxproben entnommen. Für alle Arten von Assays wurde die RNA-Isolierung und -Amplifikation mit den von den jeweiligen Herstellern empfohlenen Methoden und Kits durchgeführt.
Diese Studie zeigte, dass der Abbott-Test für SARS-CoV-2 die gleiche Erkennungsleistung wie CRS aufweist, mit 100 % positiver, negativer und Gesamtkonkordanz. Cohens Kappa-Übereinstimmung beträgt 1,00, was eine vollständige Übereinstimmung mit CRS anzeigt. Eine ähnliche Studie der University of Washington in den USA ergab, dass die Gesamtsensitivität und Spezifität des Abbott-Tests für SARS-CoV-2 93 % bzw. 100 % im Vergleich zum laborbestimmten Assay (LDA) des CDC betrug . 11. Das SARS-CoV-2-Nachweissystem von Abbott basiert auf dem gleichzeitigen kombinierten Nachweis der N- und RdRp-Gene, da beide Gene empfindlicher sind, wodurch falsch-negative Ergebnisse minimiert werden12. Eine Studie in Wien, Österreich, zeigte außerdem, dass große Extraktionsprobenvolumina und Detektionselutionsvolumina Verdünnungseffekte minimierten und die Detektionseffizienz erhöhten13. Somit kann Abbotts perfekte Ergänzung für den SARS-CoV-2-Assay mit einem Plattformerkennungssystem in Verbindung gebracht werden, das gleichzeitig kombinatorische Gene erkennt, eine große Anzahl von Proben (0,5 ml) extrahiert und eine große Menge an Eluent (40 µl) verwendet.
Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass die Nachweisleistung des Daan-Gentests nahezu mit der von CRS übereinstimmte. Dies steht im Einklang mit einer Studie14, die an der Anhui-Universität in Huainan, China, durchgeführt wurde, und der Behauptung des Herstellers einer 100 % positiven Übereinstimmung. Trotz Berichten über konsistente Ergebnisse war eine Probe nach einem erneuten Test desselben Eluats falsch negativ, war jedoch in den Abbott SARS-CoV-2- und Sansure Biotech nCoV-2019-Tests positiv. Dies deutet darauf hin, dass es bei verschiedenen Testarten zu unterschiedlichen Ergebnissen kommen kann. Dennoch unterschied sich das Ergebnis des Daan-Gentests in der in China durchgeführten Studie15 deutlich (p < 0,05) von dem im Labor definierten Referenztest. Dennoch unterschied sich das Ergebnis des Daan-Gentests in der in China durchgeführten Studie15 deutlich (p < 0,05) von dem im Labor definierten Referenztest. In den letzten 15 Jahren wurde die Analyse von Daan Gene von einer Laboranalyse positiv bewertet (p < 0,05). Allerdings unterschied sich das Analyseergebnis von Daan Gene in einer Studie in China15 deutlich (p < 0,05) von der Laborreferenzanalyse.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（S < 0,05）。然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Laut einer Studie, die in China nachgewiesen wurde, ergaben 15 Ergebnisse, dass der genetische Test von Daan aufgrund seiner Etablierung positiv bewertet wurde (p < 0,05). Labortest. Allerdings unterschieden sich die Ergebnisse des Gentests von Daan in einer Studie in China15 deutlich (p < 0,05) von denen des Referenzlabortests.Diese Diskrepanz kann auf die Empfindlichkeit des Referenztests zum Nachweis von SARS-CoV-2 zurückzuführen sein, und weitere Studien könnten wichtig sein, um die Ursache zu ermitteln.
Darüber hinaus bewertete unsere Studie die vergleichende Leistung des SARS-CoV-2-BGI-Assays mit CRS und zeigte eine ausgezeichnete positive prozentuale Übereinstimmung (PPA = 97,9 %), negative prozentuale Übereinstimmung (NPA = 100 %) und insgesamt prozentuale Übereinstimmung nach Geschlecht ( OPA). ). = 98,8 %). Cohens Kappa-Werte zeigten eine gute Übereinstimmung (K = 0,975). Studien in den Niederlanden16 und China15 haben konsistente Ergebnisse gezeigt. Der SARS-CoV-2-BGI-Test ist ein Einzelgen-Nachweistest (ORF1a/b) unter Verwendung von 10 µl Amplifikations-/Nachweis-Eluat. Trotz guter statistischer Übereinstimmung mit unseren Referenzergebnissen übersah die Analyse zwei positive Proben (1,22 %) der Gesamtprobe. Dies kann enorme klinische Auswirkungen auf die Übertragungsdynamik sowohl auf Patienten- als auch auf Gemeinschaftsebene haben.
Eine weitere vergleichende Analyse, die in diese Studie einbezogen wurde, war der Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO)-Assay; Die Gesamtübereinstimmungsquote betrug 96,3 %. Die Stärke der Übereinstimmung wurde auch durch den Kappa-Wert von Cohen bestimmt, der 0,925 betrug und eine vollständige Übereinstimmung mit dem CRS anzeigte. Auch hier sind unsere Ergebnisse identisch mit Studien, die an der Central South University in Changsha, China, und in der klinischen Laborabteilung des Liuzhou People's Hospital, Stadt Liuzhou, China, durchgeführt wurden17. Obwohl die oben genannte gute statistische Übereinstimmung festgestellt wurde, zeigte der Chi-Quadrat-Test (MacNemar-Test), dass das Ergebnis des Sansure Biotech-Tests einen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zum CRS aufwies (p < 0,005). Obwohl die oben genannte gute statistische Übereinstimmung festgestellt wurde, zeigte der Chi-Quadrat-Test (MacNemar-Test), dass das Ergebnis des Sansure Biotech-Tests einen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zum CRS aufwies (p < 0,005). Darüber hinaus wurde das Kriterium „Makro-Kriterium“ (Kriterium „Maknemar“), das eine sehr gute statistische Analyse darstellt, bestätigt Die von Sansure Biotech analysierten Ergebnisse weisen eine Reihe von statistischen Ergebnissen nach CRS auf (p < 0,005). Obwohl die oben genannte gute statistische Übereinstimmung festgestellt wurde, zeigte der Chi-Quadrat-Test (McNemar-Test), dass das Ergebnis des Sansure Biotech-Assays einen statistisch signifikanten Unterschied zum CRS aufwies (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性, 但卡方检验 (MacNemar 检验）表明, Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异（p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性, 但 检验 (（（macnemar 检验 表明), Sansure Biotech 检测 结果 与 crs相比 具有 显着 ((p <0,005). Als Ergebnis einer sehr guten statistischen Analyse hat mir das Kriterium „Makro“ eine statistische Bewertung (S. <) angezeigt 0,005) nach der Analyse von Sansure Biotech und CRS. Trotz der oben erwähnten guten statistischen Übereinstimmung zeigte der Chi-Quadrat-Test (McNemar-Test) einen statistisch signifikanten Unterschied (p < 0,005) zwischen dem Sansure Biotech-Assay und dem CRS.Sechs Proben (3,66 %) erwiesen sich im Vergleich zu CRS als falsch negativ (Ergänzungstabelle 1); Dies ist sehr wichtig, insbesondere angesichts der Dynamik der Übertragung des Virus. Die oben genannten Daten unterstützen auch diese niedrige Erkennungsrate15.
In dieser Studie wurden die Ct-Werte für jeden Assay und die jeweilige Plattform bestimmt, wobei der niedrigste mittlere Ct-Wert im Abbott SARS-CoV-2-Assay gemeldet wurde. Dieses Ergebnis könnte mit dem simultanen kombinierten Gentestsystem von Abbott zum Nachweis von SARS-CoV-2 zusammenhängen. Daher wiesen laut Abbildung 1 87,6 % der Abbott SARS-CoV-2-Ergebnisse Ct-Werte unter 20 auf. Nur eine kleine Anzahl von Probenergebnissen (12,4 %) lag im Bereich von 20–30. Ct-Werte über 30 wurden nicht erfasst. Zusätzlich zur Verwendung des SARS-CoV-2-Panel-Gentestformats durch Abbott hängt dieses Ergebnis möglicherweise mit der unteren Nachweisgrenze (32,5 RNA-Kopien/ml)18 zusammen, die dreimal niedriger ist als die Untergrenze des Unternehmens von 100 RNA-Kopien /ml. ml)19.
Diese Studie weist einige Einschränkungen auf: Erstens verfügen wir aufgrund fehlender Ressourcen nicht über Standard-/Referenzmethoden [wie Viruslast- oder andere Labortests (LDA)]. Zweitens handelte es sich bei allen in dieser Studie verwendeten Proben um Nasopharynxabstriche, während die Ergebnisse nicht auf andere Probentypen anwendbar waren, und drittens war unsere Probengröße klein.
In dieser Studie wurde die Leistung von vier rRT-PCR-Assays für SARS-CoV-2 unter Verwendung von Nasopharynxproben verglichen. Mit Ausnahme des Sansure Biotech-Assays hatten alle Nachweistests eine nahezu vergleichbare Leistung. Außerdem wurde im Sansure Biotech-Assay im Vergleich zum CRS eine niedrige Positivitätsrate festgestellt (p < 0,05). Außerdem wurde im Sansure Biotech-Assay im Vergleich zum CRS eine niedrige Positivitätsrate festgestellt (p < 0,05). Darüber hinaus erzielte Sansure Biotech im Test nur wenige Prozent mehr Ergebnisse als CRS (p < 0,05). Darüber hinaus zeigte der Sansure Biotech-Test im Vergleich zum CRS einen geringen Prozentsatz positiver Ergebnisse (p < 0,05).Nach Angaben der CRS-Studie hat Sansure Biotech eine neue Studie durchgeführt (p < 0,05).Nach Angaben der CRS-Studie hat Sansure Biotech eine neue Studie durchgeführt (p < 0,05). Darüber hinaus analysierte Sansure Biotech mehr als ein Dutzend neue Ergebnisse mit CRS (p < 0,05). Darüber hinaus wies der Sansure Biotech-Assay im Vergleich zum CRS eine niedrigere Positivitätsrate auf (p < 0,05).Die Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO)-Analyse von PPA, NPA und Gesamtübereinstimmung überstieg 93,5 % mit einem Cohen-Kappa-Stärke-der-Übereinstimmungswert von 0,925. Schließlich muss der Sansure Biotech Assay (RUO) für die Verwendung in Äthiopien weiter validiert werden, und es sollten zusätzliche Untersuchungen in Betracht gezogen werden, um die Angaben einzelner Hersteller zu bewerten.
Das Design der Vergleichsstudie wurde in vier Gesundheitseinrichtungen in Addis Abeba durchgeführt: im Eka Kotebe Hospital, im Millennium Church Treatment Centre, im Zewooditu Memorial Hospital und im St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. Die Daten wurden zwischen dem 1. und 31. Dezember 2020 erhoben. Die medizinischen Einrichtungen für diese Studie wurden gezielt aufgrund ihrer hohen Fallzahlen und der Verfügbarkeit großer Behandlungszentren in der Stadt ausgewählt. In ähnlicher Weise wurden Instrumente, einschließlich der Echtzeit-PCR-Instrumente ABI 7500 und Abbott m2000, gemäß den Empfehlungen der NAAT-Reagenzhersteller ausgewählt, und für diese Studie wurden vier PCR-Nachweiskits ausgewählt, die in den meisten Labors in Äthiopien verwendet wurden vier davon. Während der Studie durchgeführter Gentest, Abbott SARS-CoV-2-Test, Sansure Biotech-Test und SARS-CoV-2-BGI-Test.
Tests auf SARS-CoV-2 wurden vom 1. bis 30. Dezember 2020 unter Verwendung von 3 ml Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) von Personen durchgeführt, bei denen eine Untersuchung auf COVID-19 durchgeführt wurde, die an EPHI verwiesen wurde. Nasopharyngeale Proben wurden von geschulten Probensammlern gesammelt und in Dreierpackungen an EPHI geschickt. Vor der Nukleinsäureisolierung wird jeder Probe eine eindeutige Identifikationsnummer zugewiesen. Die Extraktion jeder Probe erfolgt unmittelbar nach Eingang mithilfe manueller und automatischer Extraktionsmethoden. Daher wurden für die automatische Extraktion von Abbott m2000 1,3 ml (einschließlich 0,8 ml Totvolumen und 0,5 ml Extraktionseinlassvolumen) der Probe aus jeder Probe extrahiert und durch das Abbott DNA Sample Prepared System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) Eine Charge von 96 [92 Proben, zwei Nachweiskontrollen und zwei Nicht-Template-Kontrollen (NTC)] wurde in den Gesamtprozess (Entnahme und Nachweis) von zwei Runden von SARS-CoV-2 (EUA) in Echtzeit einbezogen. Bergbau. Ebenso verwenden Sie für die manuelle Extraktion dieselben Proben (für die automatische Extraktion und Erkennung). Daher wurden während des gesamten Prozesses 140-µl-Proben aliquotiert und mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) in Chargen von 24 (einschließlich 20 Proben, zwei Testkontrollen und zwei NTCs) über neun Runden extrahiert. Manuell extrahierte Eluate wurden mit einem ABI 7500-Thermocycler unter Verwendung des SARS-CoV-2-BGI-Assays, des Daan-Gen-Assays und des Sansure-Biotech-Assays amplifiziert und nachgewiesen.
Die automatisierte Isolierung und Reinigung von SARS-CoV-2-Virus-RNA folgt dem Magnetkügelchen-Prinzip unter Verwendung von Abbott DNA-Probenvorbereitungsreagenzien. Die Inaktivierung von Proben und die Solubilisierung von Viruspartikeln erfolgt mithilfe eines Detergens, das Guanidinisothiocyanat enthält, um das Protein zu denaturieren und RNase zu inaktivieren. Anschließend erfolgt die Trennung der RNA vom Protein durch Festphasentrennung mittels Kieselsäure, d. h. das Guanidiniumsalz und der alkalische pH-Wert des Lysepuffers begünstigen die Bindung der Nukleinsäuren an die Kieselsäure (SiO2). Der Spülschritt entfernt verbleibende Proteine ​​und Ablagerungen, um eine klare Lösung zu erzeugen. Transparente RNA wird mithilfe des Magnetfelds des Instruments aus Mikropartikeln auf Siliciumdioxidbasis isoliert20,21. Andererseits erfolgt die manuelle Isolierung und Reinigung von RNA durch die Spin-Säulen-Methode unter Verwendung von Zentrifugation anstelle eines Magnetständers und der Trennung von Mikropartikeln vom Eluenten.
Der Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, der EUA19,22 von der WHO und der FDA erhielt. In diesem Protokoll wurde die Probeninaktivierung vor der Extraktion 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 56 °C durchgeführt. Nach der Virusinaktivierung wurde die Nukleinsäureextraktion auf einem Abbott m2000 SP-Gerät aus 0,5 ml VTM unter Verwendung eines Abbott m2000 DNA-Probenvorbereitungssystems durchgeführt. laut Hersteller. Amplifikation und Nachweis wurden mit einem Abbott m2000 RT-PCR-Gerät durchgeführt, und für die RdRp- und N-Gene wurde ein doppelter Nachweis durchgeführt. ROX) und VIC P (proprietärer Farbstoff) zum Targeting und Nachweis interner Kontrollen, was den gleichzeitigen Nachweis beider Amplifikationsprodukte ermöglicht 19 .
Die Amplifikationsnachweismethode dieses Kits basiert auf der einstufigen RT-PCR-Technologie. Die ORF1a/b- und N-Gene wurden von Daan Gene Technology als konservierte Regionen ausgewählt, um die Amplifikation der Zielregion nachzuweisen. Für den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in Proben wurden spezifische Primer und Fluoreszenzsonden (mit FAM markierte N-Gensonden, mit VIC markierte ORF1a/b-Sonden) entwickelt. Der endgültige Eluent und die Master-Mischungen wurden durch Zugabe von 5 µl Eluent zu 20 µl des Master-Mix bis zu einem Endvolumen von 25 µl hergestellt. Amplifikation und Detektion wurden gleichzeitig auf einem ABI 750024 Echtzeit-PCR-Gerät durchgeführt.
Die ORF1a/b- und N-Gene wurden mit dem Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (Fluoreszenz-PCR-Nachweis) nachgewiesen. Bereiten Sie spezifische Sonden für jedes Zielgen vor, indem Sie den FAM-Kanal für die ORF1a/b-Region und den ROX-Kanal für das N-Gen auswählen. Zu diesem Testkit werden Eluent und Master-Mix-Reagenzien wie folgt hinzugefügt: Bereiten Sie 30 µl Master-Mix-Reagenz und 20 µl eluierte Probe für die Detektion/Amplifikation vor. Zur Amplifikation/Detektion wurde Real-Time PCR ABI 750025 verwendet.
Der SARS-CoV-2 BGI-Test ist ein fluoreszierendes Echtzeit-rRT-PCR-Kit zur Diagnose von COVID-19. Die Zielregion befindet sich in der ORF1a/b-Region des SARS-CoV-2-Genoms, bei der es sich um eine Einzelgen-Nachweismethode handelt. Darüber hinaus ist das menschliche Haushaltsgen β-Aktin ein intern reguliertes Zielgen. Der Mastermix wird durch Mischen von 20 µl des Mastermix-Reagenzes und 10 µl der extrahierten RNA-Probe in einer Wellplatte26 hergestellt. Zur Amplifikation und Detektion wurde ein fluoreszierendes quantitatives Echtzeit-PCR-Gerät ABI 7500 verwendet. Die gesamte Nukleinsäureamplifikation, die PCR-Laufbedingungen für jeden Assay und die Interpretation der Ergebnisse wurden gemäß den Anweisungen des jeweiligen Herstellers durchgeführt (Tabelle 3).
In dieser vergleichenden Analyse verwendeten wir nicht die Referenzstandardmethode, um die prozentuale Übereinstimmung (positiv, negativ und insgesamt) und andere Vergleichsparameter für die vier Analysen zu bestimmen. Jeder Testvergleich wurde mit CRS durchgeführt. In dieser Studie wurde das CRS durch die Regel „jedes positive Ergebnis“ festgelegt und das Ergebnis wurde bestimmt, nicht durch einen einzelnen Test, wir verwendeten mindestens zwei übereinstimmende Testergebnisse. Darüber hinaus sind falsch negative Ergebnisse im Falle einer COVID-19-Übertragung gefährlicher als falsch positive Ergebnisse. Um ein CRS-Ergebnis so genau wie möglich als „positiv“ bezeichnen zu können, müssen daher mindestens zwei Assay-Tests positiv sein, was bedeutet, dass wahrscheinlich mindestens ein positives Ergebnis aus einem EUA-Assay stammt. Somit gelten von vier Testergebnissen zwei oder mehr Testergebnisse, die das gleiche Ergebnis liefern, als richtig positiv oder negativ18,27.
Die Daten wurden mithilfe strukturierter Datenextraktionsformulare gesammelt, die Dateneingabe und -analyse erfolgte mit der Statistiksoftware Excel und SPSS Version 23.0 für deskriptive Statistiken. Positive, negative und prozentuale Gesamtübereinstimmung wurden analysiert und ein Kappa-Score wurde verwendet, um den Grad der Übereinstimmung jeder Methode mit CRS zu bestimmen. Kappa-Werte werden wie folgt interpretiert: 0,01 bis 0,20 für leichte Zustimmung, 0,21 bis 0,40 für allgemeine Zustimmung, 0,41–0,60 für mäßige Zustimmung, 0,61–0,80 für große Zustimmung und 0,81–0,99 für vollständige Zustimmung28.
Die ethische Genehmigung wurde von der Universität Addis Abeba eingeholt und alle Versuchsprotokolle für diese Studie wurden vom Scientific Ethics Review Board des Äthiopischen Instituts für öffentliche Gesundheit genehmigt. Die Referenznummer für die EPHI-Ethiklizenz lautet EPHI/IRB-279-2020. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen und Bestimmungen der äthiopischen National Comprehensive Guidelines for the Treatment of COVID-19 angewendet. Darüber hinaus wurde vor der Teilnahme an der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung aller Studienteilnehmer eingeholt.
Alle in dieser Studie gewonnenen oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten. Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.
Weltgesundheitsorganisation. Empfehlungen für Laborteststrategien für COVID-19: Interim Guidance, 21. März 2020 Nr. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
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